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ROS活性氧检测技术

产品介绍

  ROS活性氧检测技术
 ROS活性氧检测技术利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧的检测。DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜,从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF,检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

ROS活性氧检测技术

步骤

1.装载探针

1。1 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)

细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,检测时细胞汇合度达到50~70%

】:细胞状态健康,且检测时不会过度生长。

药物诱导:去除细胞培养液,加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物,于37细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。

(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100mM到常用工作浓度100μM,加入细胞,一般37避光孵育30min-4h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如,HeLa细胞孵育30minMRC5人胚胎成纤维细胞1。5h;】

探针准备:探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。

探针装载:吸除诱导用药物,加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。如,对于6孔板通常不少于1000μl,对于96孔板通常不少于100μl37细胞培养箱内避光孵育30 min

细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA

1。2 收集细胞后装载探针:适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

细胞准备:按照标准方法培养细胞,检测用细胞状态健康。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。

药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于37细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。

(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100mM到常用工作浓度100μM,加入细胞,一般37避光孵育30min-4h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。【如,HeLa细胞孵育30minMRC5人胚胎成纤维细胞1.5h;】

探针准备:探针装载前,按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM

探针装载去除细胞内药物,离心收集细胞,加入适当稀释好的探针,使其细胞密度为1。0×106~2.0×107。【】:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整。如,对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106。每隔3-5min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。

细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA

2。检测

原位装载探针法:激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

收集细胞后装载探针:用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3.参数设置

使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测DCF。

ROS活性氧检测技术

注意事项

1 探针装载后,要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。

2 探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。

3 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。

4 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

目前,上海剑钝生物科技有限公司主营实验技术服务,动物模型构建,SCI服务,试剂盒,细胞株等,欢迎广大科研者前来购买!

 

 

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